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脑组织实验前处理方法及常见的问题

TIEM： 2022-12-02 3276

脑组织实验前处理方法及常见的问题

一、灌注取材：

灌注的必要性：

①脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好在取脑组织前用4%多聚甲醛灌注固定；

②经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤；

③脑内血液丰富，经灌注后，可去除红细胞。

灌注方法：心脏灌注法

心脏灌注原理：

心脏灌注术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定，避免了组织的自溶现象，是脑组织切片观察的常用方法。

心脏灌注方法：

先把老鼠麻醉，沿胸骨柄剪开胸腔，剪开心包膜，暴露心脏，与心尖呈30-45°夹角剪开左心室，将灌注针从左心室插入主动脉，固定针头，再剪开右心耳，然后快速用生理盐水（大鼠100-150ml）冲洗血液，至流出液体血色较浅基本澄清（肝脏、眼珠、爪子迅速变白是排除血液的有效观察标志），再先快后慢注入4%多聚甲醛250ml（大鼠）固定，先后所需50min，多聚甲醛进入大鼠体内，大鼠会出现四肢、尾的抽搐，最终以肝脏发白、内脏鼓起即灌注好。然后取材，取完后的脑组织再放置4%多聚甲醛中4度冰箱进行后固定，时间12-24小时。

注意事项：

暴露心脏这一步，容易损伤肺、心脏或者肝脏，“夹持剑突并向上提拉，用弯剪再膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸”人工气胸后，肺萎缩，胸腔里的空间增大，提拉剑突就不容易损伤肺、心脏及肝脏，出血少。
经心脏灌注，有时穿刺会误进右心室，那样灌注主要再肺循环起作用，体循环的血液影响不大。所以将穿刺针插入到主动脉内才可以确保起到体循环灌注冲洗血液的效果，脑组织的血液冲干净后，才不会影响免疫组化的效果，不然到处都是红细胞造成的背景染色。
灌注时注意排空输液管中的气泡，不然容易血栓，影响灌注效果。一定要看到大鼠较剧烈抽搐，不然证明灌注不好。
灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠剧烈抽动；成功后老鼠后肢绷直，尾部竖起成一条直线；所灌注的脑组织白而硬。
去颅骨后脑表面有一层硬脑膜，要去掉。
小鼠的灌注液用量：生理盐水20-30ml，多聚甲醛20ml左右。

常见的问题：

1.没有灌注固定的大鼠脑组织能不能做切片和免疫组化？

如果没有灌注固定，而是直接取材然后放固定液中，可以进行免疫组化染色，只是效果没有灌注固定的效果好。
尤其是要做免疫电镜时更明显。有时标记蛋白要求较高，固定不好就难以染好。

2.用4%多聚甲醛固定但保存了2周才做石蜡切片，对免疫组化有无影响？

固定时间过长蛋白多肽链都交联在一起了，抗原性就很弱了，很可能没有阳性结果，抗原修复时一般的修复很难把抗原性恢复，可能会有影响，但不会太大。固定时间长，抗原修复时间也要长一些。

3.灌注过的脑组织不可以用于Western blot及PCR实验的原因是什么？

多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体，准确检测其表达的位置和量。
Western blot实验中，要用去污剂使各种蛋白发生变性、解聚，并变成统一的线性肽链，从而能够用凝胶电泳进行分子量的梯度分离。多聚甲醛会影响蛋白的解聚，从而使其无法用凝胶分离。另外，WB和免疫组化所使用抗体的抗原表位也不同，WB的抗体一般识别蛋白的一级结构，所以可能也无法识别甲醛处理的蛋白。
PCR要提RNA,RNA非常容易降解，必须新鲜取组织，然后尽快超低温冷藏或者马上抽提，否则非常容易降解，灌注固定的组织，原则上是能够提出RNA和DNA的，但是肯定会有较多的降解，一般不会这样做。

常切的位置

常切的位置有前额叶皮层、纹状体、海马、下丘脑、黑质、小脑

二、包埋切片：

①如做冰冻切片，先蔗糖脱水，待组织沉底，即可做OCT包埋、冰冻切片，切片-20℃保存；

②如做石蜡切片，酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片，切片常温保存，如果后期做免疫实验，封蜡4℃保存；

三、染色：

脑组织常做的染色及指标：HE、尼氏、LFB 、GFAP、iba-1、NEUN、TH、c-fos。